一句话判断与关键数字

核心判断:逆折叠把"结构到序列"的映射用作设计工具。给定目标骨架,模型输出一条或多条能编码该骨架的氨基酸序列。它把蛋白设计从"搜索能量最低的序列"改写为"学习条件分布 P(序列 | 骨架),再从中采样"。在目前最常见的从头设计管线(骨架生成 → 逆折叠 → 再折叠过滤 → 实验)中,逆折叠是成本最低的一环,ProteinMPNN 系列也是实验验证最充分的序列设计工具之一。但它只回答"这条序列与该骨架的兼容程度",不回答这条序列能否在细胞中表达、折叠成单一构象、结合靶标或催化反应。因此,序列恢复率与再折叠分数是有用的筛选代理,应与实验终点分层报告,不能互相替代。
52.4%ProteinMPNN 在天然骨架上的序列恢复率(Rosetta 固定骨架设计为 32.9%)
1.2 sProteinMPNN 设计 100 残基的耗时;同一测试集上 Rosetta 为 4.3 min
63.3%LigandMPNN 对与小分子接触残基的序列恢复率(ProteinMPNN 为 50.5%)
1.5–2 Å文献中常用的 scRMSD 设计阈值之一;各研究取值不统一,pLDDT 阈值常见 70–90

问题定义:从正问题到逆问题

蛋白质的氨基酸序列决定其三维结构。因此,"给定序列求结构"是正问题,由结构预测模型完成(例如 AlphaFold2 与 ESMFold);"给定结构求序列"是逆问题,由逆折叠模型完成。设计者需要的通常是后者:先确定一个执行功能所需的三维骨架,再找出能稳定它的序列。

形式上,给定目标骨架 x*,设计目标是找到序列 s,使 s 在折叠能量景观中以 x* 为唯一或主导的稳定构象。逆折叠模型学习条件分布 Pθ(s | x*),并从中采样候选序列。再折叠(refolding)模型 F 对每条候选序列做结构预测,检验 F(s) 与 x* 的偏差。前者是生成步骤,后者是代理评估步骤。整个报告的核心分界就在这两步之间。

术语与早期工作的脉络如下:

方法谱系:从物理能量到条件生成

下表列出与本报告直接相关的逆折叠或设计用序列模型。性能数字均为原文或预印本报告的数字,测试集各不相同,表中不做横向排名。Korbeld 等(2026)引述 Albanese 等(2025)的看法,认为 ProteinMPNN 系列是序列设计方法中实验验证最充分的一类。

年份 · 来源方法输入 → 输出作者报告的关键结果证据级别
2019 · Ingraham et al., NeurIPS图结构条件生成(relational language model)骨架图 → 序列在速度与可靠性上优于此前的神经网络序列设计方法(论文表述)同行评议会议论文
2021 · Jing et al., ICLR几何向量感知器(GVP)蛋白结构 → 序列(设计任务之一)在设计与模型质量评估任务上优于既有图与体素方法同行评议会议论文
2022 · ProteinMPNN(Dauparas et al., Science)消息传递神经网络(MPNN),自回归解码骨架 → 序列;支持同源寡聚体的位置耦合天然骨架恢复 52.4%(Rosetta 32.9%);重新设计了若干失败的 Rosetta 或 AF2 设计同行评议,多项实验
2022 · ESM-IF1(Hsu et al., ICML)几何输入层 + 序列到序列 Transformer;用 1200 万条 AF2 预测结构扩充训练骨架 → 序列CATH 留出骨架上恢复 51%,埋藏残基 72%同行评议会议论文
2025 · LigandMPNN(Dauparas et al., Nat Methods)在 ProteinMPNN 基础上加入配体、核酸、金属的原子上下文骨架 + 非蛋白原子 → 序列(并输出侧链构象)与小分子接触残基恢复 63.3%;报告 100 多个实验验证的小分子与 DNA 结合设计同行评议
2025 · Cho et al., Nat Commun联合优化 P(序列 | 结构) 与 P(结构 | 序列)序列与结构双向约束大规模稳定性测量中,联合优化优于单向的逆折叠设计(作者报告)同行评议
2025–2026 · DynamicMPNN(arXiv 2507.21938)面向多构象集合的 MPNN 变体构象集合 → 序列以 decoy 归一化 RMSD 计,相对 ProteinMPNN 最高提升 25%;序列恢复率提升 12%(作者报告,其基准)会议版本存在;数字为作者报告
2026 · Inverse FoldDir(bioRxiv 预印本)Dirichlet 流匹配,在氨基酸概率单纯形上迭代去噪骨架 → 序列分布;支持固定残基与软性偏好CATH 4.2 上 TM-score 84.5,ESM-IF1 为 83.3;纳米抗体重设计 35 条中 2 条重现结合信号预印本,未经同行评议

ProteinMPNN:为什么它成为默认件

ProteinMPNN 是当前管线中使用最广的逆折叠模型,其设计选择直接决定了后续使用方式。

原文的一个判断值得保留:序列恢复率是对天然结构的一种代理,但"在天然骨架上恢复天然序列"并不等价于"在新骨架上折叠成功"。作者自己也写道,最终检验必须是实验表征。这一判断在后面的评估章节中会再次出现。

从头设计管线:骨架生成、逆折叠与过滤

当前的从头设计管线大体可以分成四步。每一步都可以替换,但责任划分基本固定。

1 · 骨架生成

用扩散或流匹配模型生成目标骨架,例如 RFdiffusion(微调 RoseTTAFold,Watson et al., Nature 2023)。也可由 BindCraft 等基于 AF2 权重的流程同时生成骨架与序列。

→

2 · 逆折叠

对每个骨架采样多条候选序列。Trippe 等(2023)的自洽评估中,每个骨架用 ProteinMPNN 采样 8 条序列,采样温度设为 0.1。

→

3 · 再折叠过滤

用 AF2、ESMFold、AF3 或 Boltz 等模型重新预测候选序列,计算 pLDDT 与 scRMSD,只保留通过阈值的序列。

→

4 · 实验验证

测表达量、单分散性(SEC)、二级结构(CD),解析结构(X 射线、冷冻电镜或 NMR),并测结合或功能(BLI、SPR 或酵母展示)。

过滤步骤的效果有定量报告。Bennett 等(2023)发现,用 AF2 或 RoseTTAFold 评估设计序列采用目标单体结构的概率,以及该结构按设计结合靶标的概率,可使设计成功率提高近 10 倍。同一研究显示,用 ProteinMPNN 替代 Rosetta 设计序列,显著提高了计算效率。

需要注意的是,过滤阈值没有公认标准。Korbeld 等(2026)的分析指出,文献中 scRMSD 阈值常取 1.5–2 Å,也有用 TM-score 0.5 作为阈值的;pLDDT 阈值的取值范围为 70–90,且各研究是临时选定的。因此,对比两项研究的"设计成功率"时,必须先核对阈值。

幻觉与循环:从单向管线到结构-序列闭环

上述管线是单向的:骨架确定后,序列只被设计一次。另一类方法把结构预测网络反过来用于生成,形成结构与序列之间的迭代循环。这类方法常被称为幻觉(hallucination)。讲稿把它与大语言模型的"编造"作了区分:这里指的是结构预测网络对本不能折叠的序列给出折叠结构。

6.1 trRosetta 幻觉:结构预测网络用于生成

Anishchenko 等(2021)从随机序列出发,用 trRosetta 预测残基间距离分布,再用蒙特卡洛方法优化序列,使预测分布相对背景分布的 KL 散度最大化。研究合成了 129 条幻觉序列的基因,其中 27 条表达为单分散蛋白,且圆二色谱(CD)与模型一致。作者解析了其中 3 个结构,两个由 X 射线晶体学,一个由 NMR,结构都与幻觉模型接近。这项工作表明,结构预测网络确实包含可用于生成全新折叠的信息。

6.2 BindCraft:AF2 权重驱动的结合蛋白循环

Pacesa 等(2025)的 BindCraft 以 AF2 权重从靶标结构出发,同时生成结合体骨架与序列;随后用 MPNN 类求解器优化结合体的表面与核心,并保持界面不变;最后用 AF2 单体预测过滤。作者报告实验成功率为 10%–100%(按靶标不同),并得到纳摩尔级亲和力的结合体,且不需要高通量筛选或实验优化。BindCraft 与 ProteinMPNN 的关系是互补的:前者负责界面与整体骨架的梯度优化,后者负责把骨架上的非界面位置填上合适的序列。

6.3 讲稿中的 AF3 循环(口述,本报告未核验原始数据)

曹龙兴在"百家论坛第十期"的报告(本地存档于 sources/)描述了一套以 AF3 结构预测与 ProteinMPNN 序列设计交替进行的循环。主要陈述如下,均为口述,未在本报告中找到对应的完整已发表数据:

方法生成对象循环内部的操作报告的实验结果证据级别
trRosetta 幻觉(Anishchenko 2021)全新折叠蛋白(无预设骨架)距离分布 KL 优化序列129 条基因,27 条单分散且 CD 一致,3 个结构解析同行评议
BindCraft(Pacesa 2025)结合体骨架与序列AF2 界面优化;MPNN 优化表面与核心;AF2 单体过滤实验成功率 10%–100%,纳摩尔亲和力同行评议
AF3–ProteinMPNN 交替循环(讲稿)小分子结合体、纳米抗体 CDR、醛缩酶等AF3 预测与 ProteinMPNN 设计交替讲稿口述,细节未核验口述,待发表

配体、核酸与金属:逆折叠为何需要原子上下文

ProteinMPNN 只看到蛋白主链的几何信息和残基类型,看不到配体、核酸或金属原子。因此,在界面残基上,它的序列恢复率明显低于蛋白内部残基。LigandMPNN 的主要改动是把非蛋白原子作为图的一部分纳入模型,并输出侧链构象。作者在天然骨架上的比较如下(序列恢复率):

界面类型RosettaProteinMPNNLigandMPNN
与小分子接触的残基50.4%50.5%63.3%
与核酸接触的残基35.2%34.0%50.5%
与金属配位的残基36.0%40.6%77.5%

数字来自 Dauparas 等(2025, Nat Methods)摘要中的天然骨架结果;测试集与 ProteinMPNN 原文不同,不宜与其他章节的数字直接相加或比较。

作者还报告,LigandMPNN 已用于设计 100 多个经实验验证的小分子与 DNA 结合蛋白,其中若干设计经 X 射线晶体学验证;对 Rosetta 设计的小分子结合体进行重设计,亲和力最多提高约 100 倍。对于金属结合,原子上下文尤其关键,因为配位几何对残基位置的约束很严。

讲稿中的一个观点与此相关:讲者认为,当前大多数 AI 方法只能判断"结合或不结合",难以建模"诱导"(induction),即一个小分子是否能把两种构象之间的平衡推向目标状态。这一观点是讲者的判断,未在本报告中核验,但它指向了一个具体的设计问题:界面上的结合能与构象能之间的平衡,单靠序列恢复率无法体现。

多构象设计:单态假设的边界

标准逆折叠假设目标只有一个构象。然而,许多功能依赖构象变化:开关、铰链、变构调节与部分酶的催化循环都涉及多个状态。单态模型在这些情形下的局限,可以从几个方面看:

对设计团队的含义是:如果目标是开关或铰链类蛋白,应对每个目标构象分别做再折叠检验,并要求所有构象都自洽,同时检验"竞争构象"不被稳定。单一最佳构象的分数不能代表这一要求。

证据层级:序列恢复、再折叠自洽与实验终点

本报告把证据分为五个层级。下表说明每一层能支持什么结论,不能支持什么结论。这一分层的目的,是防止代理指标被当作实验结果来报告。

证据层级典型指标能支持的结论不能支持的结论已知偏差
L1 天然骨架上的序列恢复恢复率(如 ProteinMPNN 52.4%,Rosetta 32.9%)模型学到了天然序列与结构之间的统计关系在从头骨架上的可折叠性随埋藏程度变化;高恢复率可能伴随多样性下降(ProteinInvBench 指出的风险)
L2 再折叠自洽pLDDT;scRMSD 或 TM-score某个折叠模型认为该序列会折叠到目标结构真实折叠;唯一构象;实验表达阈值无统一标准;进化信息会削弱判别力(Korbeld 等 2026);柔性末端会虚增 scRMSD
L3 基准上的可折叠性refoldability(如 PDB-Struct)不同方法的相对排序单个设计的成功概率高恢复率的方法未必在该指标上表现好(PDB-Struct 原文)
L4 按长度分层的评估scTM 中位数随长度的变化长链设计需要单独评估所有长度上通用的性能不同基准的骨架集不同,数字不可直接比较
L5 湿实验终点表达、单分散、CD 或 SEC、结构解析、结合或功能设计的物理可实现性与功能方法的普遍成功率成功率随靶标差异很大(BindCraft 报告 10%–100%)

L4 的一个例子来自 ProteinBench 的从头骨架评估。作者报告的 scTM 中位数如下(同一基准内比较):

骨架长度(残基)100200300400500
ProteinMPNN0.9620.9450.9620.8750.568
ESM-IF10.8100.6350.3360.4490.462

数据来自 ProteinBench(proteinbench.github.io,ICLR 2025 投稿版)表 2,作者报告的中位数。该基准的骨架集与本报告其他来源不同。表中两模型在各长度上的比较只在该基准内有效。

这张表有两点值得注意。第一,两个模型在 500 残基时的 scTM 都明显低于 100 残基时,长链是共同难点。第二,在这个基准中 ProteinMPNN 在各长度上都高于 ESM-IF1,但这是单一基准的结果,不能推广为通用排名。

对设计团队的工程建议(本报告推论)

以下建议由本报告基于上述证据推导,不是原文作者的声明。

1. 把逆折叠当作候选提议器,而非判决器

每个骨架采样足够多的候选序列,再用多个独立的再折叠模型过滤。不要只依据一个模型的最佳分数选择序列。采样数量和温度应与其他参数一起报告。

2. 完整报告再折叠设置

写明模型名称与版本、是否使用多序列比对(MSA)或单序列模式、pLDDT 与 scRMSD 的阈值、是否截断柔性末端、采样温度与样本数。缺少这些信息时,设计成功率无法比较。

3. 长链与多结构域单独评估

对较长的骨架(ProteinBench 的数字显示 400–500 残基段下降明显),先做结构域级别或截断评估,并按长度分层报告结果。

4. 多态设计逐构象检验

对每个目标构象分别再折叠,并要求所有构象自洽、竞争构象不被稳定。实验上选择对构象敏感的读出,例如 DEER、电镜或构象特异的结合测量。

5. 界面设计使用含原子上下文的模型

涉及小分子、核酸或金属的界面,优先使用含原子上下文的逆折叠模型(如 LigandMPNN 类方法),并对配位几何做结构确认。

6. 预先定义实验接受标准

在实验开始前写明表达、单分散、二级结构与结合的接受标准。避免用再折叠分数替代实验终点;即使某条序列通过了全部再折叠阈值,也应按实验结果判定成败。

局限与证据边界

开放问题

参考文献与核验说明

  1. Dauparas J, Anishchenko I, Bennett N, et al. Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN. Science 2022. doi:10.1126/science.add2187
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  3. Hsu C, Verkuil R, Liu J, et al. Learning inverse folding from millions of predicted structures. Proceedings of ICML 2022 (PMLR 162). ESM-IF1。
  4. Ingraham J, Garg V, Barzilay R, Jaakkola T. Generative models for graph-based protein design. NeurIPS 2019.
  5. Jing B, Eismann S, Suriana P, Townshend RJL, Dror R. Learning from protein structure with geometric vector perceptrons. ICLR 2021. arXiv:2009.01411
  6. Watson JL, Juergens D, Bennett NR, et al. De novo design of protein structure and function with RFdiffusion. Nature 2023. doi:10.1038/s41586-023-06415-8
  7. Bennett NR, et al. Improving de novo protein binder design with deep learning. Nat Commun 2023. doi:10.1038/s41467-023-38328-5
  8. Trippe BL, et al. Diffusion probabilistic modeling of protein backbones in 3D for the motif-scaffolding problem. ICLR 2023. arXiv:2206.04119
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  11. Korbeld KT, Viliuga V, Fürst MJLJ. Limitations of the refolding pipeline for de novo protein design. Protein Science 2026;35(6):e70613. doi:10.1002/pro.70613
  12. Yue KT, Dill KA. 1992 年关于逆折叠问题的原始定义(转引自 Korbeld 等 2026)。
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  20. ProteinBench: A holistic evaluation of protein foundation models. proteinbench.github.io(ICLR 2025 投稿版表 2)。
  21. Multi-state protein design with DynamicMPNN. arXiv:2507.21938(会议版见 ICLR 2026 proceedings)。
  22. Inverse FoldDir: Structure-conditioned protein sequence design by Dirichlet flow matching. bioRxiv 2026, doi:10.64898/2026.09.06.749733(预印本)。
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  24. Computational protein design. Nature Reviews Methods Primers 2025. doi:10.1038/s43586-025-00383-1(综述,用于确认逆折叠在设计流程中的位置)。
  25. 曹龙兴. 从基于物理建模到深度学习的蛋白质从头设计(百家论坛第十期讲稿,本地存档 sources/)。讲稿中的所有陈述均按口述处理。

核验说明:本报告的文献数字来自 2026 年 10 月 23 日可检索到的原始论文摘要、正文或基准报告;未对任何模型做重复运行。作者报告的数字、预印本数字与讲稿口述已在正文中分别标注。若需将本报告的数字用于正式发表或申报,应回到原文核对测试集、阈值与版本。