🎯问题：胞内蛋白质组与 pMHC 的特异性困境

人类细胞相关蛋白质组中仅约 15% 存在于细胞表面，其余——包括大多数疾病驱动蛋白——都位于细胞内部，超出抗体的可及范围。然而胞内蛋白质组并非完全隐形：细胞持续降解自身蛋白，将片段以肽–MHC I 类复合物（pMHC-I）形式呈递到表面，供巡逻的 T 细胞"阅读"以决定保留或清除。因此，能识别 pMHC-I 的生物制剂理论上可以触及这些原本"不可成药"的胞内靶点。

但 pMHC 靶向面临一个核心难题——特异性而非亲和力：

传统药物发现难以应对这些约束。从患者库分离 TCR、或通过免疫和 naïve 文库筛选产生 TCR-mimic 抗体，过程缓慢、逐靶点进行，且仅对少数 pMHC 靶点成功，干净的肽级特异性更为罕见。已有成功案例验证了靶点类别的可行性：针对 p53 和突变 RAS 新抗原的 TCR-mimic 双特异性显示出临床前效力，pMHC 靶向药物已进入临床（包括已获批的 tebentafusp）。

生成式生物分子设计模型正在快速进步，让设计者能指定 binder 结合的确切表位和接触残基。JAM-2 是 Nabla Bio 约 9 个月前创建的药物级抗体全计算设计模型，已在可溶性抗原和 GPCR 等难靶上展示强亲和力、特异性和可开发性。但 pMHC 靶点难度显著更高：从头迷你蛋白 binder 虽达高亲和力但非抗体且免疫原性不确定；针对 pMHC 的从头抗体此前仅显示弱效力和有限的特异性/功能表征。计算设计尚未产出针对 pMHC 的药物级抗体。

⚙️JAM-2 设计范式：从序列到多功能抗体

仅凭序列的零样本设计

JAM-2 的输入仅为 pMHC-I 复合物的氨基酸序列（肽、HLA 重链、β2-微球蛋白），无需任何实验结构信息。每个靶点生成约 84,000 个候选 VHH 设计，每个设计同时配对一个全原子抗体–pMHC-I 复合物结构模型。

肽特异性编码策略

肽特异性被编码进设计目标的方式是：将每个呈递肽的溶剂暴露表面指定为目标表位，而非保守的 MHC-I 凹槽框架。这引导 JAM-2 优先针对独特肽表面建立接触点，而非共享的 MHC-I 支架，从而偏向无交叉反应的设计。

设计哲学的关键转变

传统发现依赖试错——筛选后才知道是否特异。JAM-2 通过设计目标预先编码特异性：把表位定义在肽暴露面上，让模型从一开始就朝"只认肽、不认 MHC 支架"的方向优化。这种"特异性 by design"是 pMHC 靶向安全性的根本保障。

从序列到功能的完整管线

设计完成后，所有靶点的设计被汇集到单个酵母表面展示文库中，与 pMHC-I 四聚体孵育筛选（HLA-A*02:01 靶点 10 nM，KRAS G12V 100 nM），同时加入脱靶四聚体评估交叉反应。两轮 FACS 分选四聚体阳性群体，NGS 测序鉴定富集序列。富集设计重构成 VHH–抗 CD3ε scFv 双特异性 T 细胞衔接器（TCE），评估 T 细胞激活和肿瘤细胞杀伤。

🧪单次战役 5/5 命中：亚纳摩尔 T 细胞激活

五个靶点跨两类 HLA 和三类抗原

靶点肽序列HLA 等位基因抗原类别
NY-ESO-1 [157-165]SLLMWITQCHLA-A*02:01肿瘤相关抗原
MAGE-A4 [230-239]GVYDGREHTVHLA-A*02:01肿瘤相关抗原
WT1 [126-134]RMFPNAPYLHLA-A*02:01肿瘤相关抗原
AFP [158-166]FMNKFIYEIHLA-A*02:01癌胎抗原
KRAS G12V [7-16]VVVGAVGVGKHLA-A*03:01新抗原

这五个靶点覆盖了新抗原、肿瘤相关抗原和癌胎抗原三类，以及全球人群中最普遍的两个 HLA I 类等位基因。KRAS G12V 源于 12 号密码子替换，存在于约 25% 的 KRAS 突变癌症中，与野生型肽仅差一个残基，对任何设计 binder 都施加了严苛的特异性要求。

命中率与交叉反应

所有五个靶点均成功回收 binder，每靶点命中率从 0.06%（KRAS G12V，48 个 binder）到 3.10%（AFP，2,558 个 binder）不等，NY-ESO-1（1.27%，1,075 个）、WT1（1.16%，973 个）、MAGE-A4（0.27%，232 个）居中。结合高度靶点受限：针对每个靶点富集的设计对任何其他 pMHC-I 四聚体产生的脱靶 binder 不超过 16 个，而靶上 binder 为 48–2,558 个。

T 细胞激活效力

每靶点最多 90 个 YSD 富集设计被重构成 TCE，用 Jurkat-NFAT 荧光素酶报告实验评估。五个靶点均显示强效、肽依赖的 T 细胞激活，对未脉冲细胞背景活性可忽略。四个靶点的顶级设计达到亚纳摩尔效力：

靶点顶级设计 EC50细胞系
KRAS G12V0.17 nMHLA-A*03:01⁺ A549
MAGE-A40.21 nMT2 (HLA-A*02:01⁺)
NY-ESO-10.22 nMT2
AFP0.88 nMT2
WT113 nMT2

每个模型中，设计的 VHH 都精确定位在溶剂暴露的肽上方，而非保守的 MHC-I 框架上，证实观察到的肽依赖激活由预期的基于结构的设计目标驱动。

🔬NY-ESO-1：单残基精度与零自体肽交叉反应

未经优化即匹敌亲和力成熟对照

对于抗 NY-ESO-1 VHH TCE，测试了两个靶上肽——天然 9C（SLLMWITQC）和锚修饰 9V 类似物（SLLMWITQV，C 端 Cys→Val 提升 HLA 结合和复合物稳定性，广泛用于 NY-ESO-1 免疫治疗）。未经任何实验亲和力成熟或优化，从头设计即刻达到两个亲和力成熟阳性对照（NYA-0060 和结构进化的 T3 Fab）的激活水平。完整剂量响应中，这些未优化设计的 EC50 低至 0.22 nM（9V 肽）。

≥216 倍自体肽选择性

为挑战从头设计的特异性，使用了一组 5 个 HLA-A*02:01 脱靶肽，来自对 14,363 个 HLA-A*02:01 九肽的计算机筛选——这些是与 NY-ESO-1 表位残基最相似的自体肽，最可能驱动严重的脱瘤毒性。

三个顶级从头设计中，所有 5 个脱靶肽驱动的 T 细胞激活均等于或低于未脉冲细胞的背景水平。每个测试设计以至少 216 倍区分靶上肽与近缘脱靶肽。由于脱靶诱导的报告活性与未脉冲对照在统计学上无法区分且低于检测限，这个倍数是功能选择性的保守下限（受限于检测动态范围），而非测得的最大上限。

丙氨酸扫描定位分子接触

对 9C 肽进行丙氨酸扫描，测量相对未修饰 9C 的功能激活。三个设计中一致的规律：

这一模式表明物理识别被精确导向独特的溶剂暴露肽表面，而非保守的 MHC-I 框架。

🧬KRAS 双变体：可编程选择性与野生型完全豁免

单残基 G12V vs 野生型区分

致癌 KRAS 12 号密码子突变与野生型仅差一个氨基酸。在 HLA-A*03:01 限制的十肽表位 VVVGAXGVGK 中，12 位残基 X 被替换为 Val（G12V）、Cys（G12C）或 Asp（G12D），与野生型 Gly 不同。治疗抗体必须严格区分致癌肽与野生型以防止严重脱瘤毒性。

全部 14 个激活的 KRAS G12V VHH-TCE 设计中，无一在野生型脉冲 A549 细胞上产生高于未脉冲细胞基线的激活——单残基 G12V vs 野生型区分是 JAM-2 设计的一致属性。单轮从头设计、无优化，最高幅度设计达到 32 倍 G12V 激活窗口，显著超过 Biocytogen 噬菌体展示来源抗 KRAS G12V/HLA-A*03:01 抗体的 8 倍窗口。

可编程的多变体选择性

单一治疗剂同时结合多种致病 KRAS 变体将扩大可治疗患者群体。常规发现战役通常优化单一靶点变体，依赖随机交叉反应来结合相关突变体。JAM-2 不受此限：逐残基指定设计目标——要求对野生型 Gly 严格选择性，同时刻意保留对 G12V 位点化学相似疏水或极性替换的宽容度。

T 细胞激活实验显示设计跨越可预测的功能表型谱。特别地，一个设计作为强效双变体衔接器，对 G12V 和 G12C 均强效激活 T 细胞（EC50 = 0.14 nM 和 2.2 nM），而对野生型或 G12D 靶标无背景以上激活。顶级从头设计匹敌或超过基准阳性对照的激活效力（G12V EC50 低至 0.14 nM vs 基准 1.2 nM）。

原代 T 细胞杀伤：EC50 = 0.07 nM

在 PBMC 杀伤实验（原代人 T 细胞介导裂解的转化相关性读数）中，三个顶级设计全部驱动 G12V 靶标的亚纳摩尔杀伤（EC50 = 0.07–0.37 nM）。双变体设计成功清除 G12C 脉冲细胞（EC50 = 1.5 nM），而无一设计对野生型或 G12D 脉冲靶标产生背景以上裂解。最强设计优于 Biocytogen 基准（EC50 = 0.07 nM vs 0.48 nM）。

临床意义

单个未优化的 JAM-2 设计 VHH-TCE 可同时应对 KRAS G12V 和 G12C 变体，两者合计约占所有 KRAS 突变恶性肿瘤的 35%。这展示了"可编程选择性"——设计者可以指定识别哪些变体、豁免哪些变体——而非被动接受随机交叉反应。

跨格式耐受性

上述功能数据均在 VHH-抗 CD3ε scFv（VHH-TCE）串联格式中产生，该格式共享无 Fc 串联 scFv/BiTE 类的缺陷。为测试设计是否耐受更具临床可行性的支架，顶级抗 KRAS 设计被重构成knobs-into-holes（KiH）IgG 样双特异性。三个顶级设计中两个经分析 SEC 确认为正确组装异二聚体，且各自保留了对靶细胞的肽依赖 NFAT 激活，证明从头设计的效力和特异性可成功跨格式转移。

📐Cryo-EM 验证：0.93 Å 原子精度与识别机制

3.25 Å 重构

为检验 JAM-2 为顶级抗 KRAS G12V VHH 预测的结合模式是否匹配实际结构，团队解析了 VHH 结合 KRAS G12V（VVVGAVGVGK）肽/HLA-A*03:01 的 cryo-EM 重构，含一个抗 β2m Fab 作为基准标记。从 566,000 个颗粒，图谱达到 3.30 Å 标称分辨率（FSC = 0.143），界面局部精修后改善至 3.25 Å。密度将 VHH 直接置于肽结合凹槽上方，结合肽的溶剂暴露面。

设计与实验的原子级吻合

设计复合物与精修坐标的最小二乘重叠给出：

这种吻合延伸到对接几何，而非仅仅折叠正确。

肽聚焦界面

VHH 埋藏了 1,018 Ų 的 pMHC 表面。虽然更大的 MHC 平台贡献了大部分（687 Ų，68%），但 10 残基肽贡献了 331 Ų（32%），且 VHH 重原子接触的 29% 是与肽形成的。按残基计，这些接触在突变位点 sharply 达峰，而非沿肽分布——与功能上观察到的肽导向特异性一致。

G12V 选择性的结构基础

结构也解释了单残基 G12V vs 野生型区分的机制：

这种基于打包的读出为功能上观察到的可编程变体选择性提供了结构依据——设计可被调节为只认 G12V，或同时认 G12V 和 G12C，而豁免野生型和 G12D——也为全部 14 个功能 G12V 设计对野生型 KRAS 的完全激活丧失和顶级设计的 32 倍窗口提供了解释。

📊可开发性：78% 设计通过全部 5 项检测

JAM-2 的关键优势是可将可开发性编码进设计目标，绕过事后优化。可开发性—— governing 抗体可制造性、稳定性和特异性的生物物理属性——是生物制剂开发的核心关卡，预测临床前负债和临床成功。以 VHH-Fc 格式独立评估（每靶点最多 8 个设计），结果如下：

检测维度阈值通过率详情
表达滴量> 150 mg/L38/38 (100%)ExpiCHO 表达
热稳定性 (DSF)Tm > 65°C34/36 (94%)Tm 范围 60–72°C
单体性 (SEC)> 90% 单体31/37 (84%)NY-ESO-1 部分设计低于阈值
多反应性 (PAIA-OVA)≤ 50% bococizumab35/38 (92%)多数比 trastuzumab 更低
多反应性 (BVP ELISA)≤ 50% bococizumab38/38 (100%)—
人源性 (序列)> 80% VH 种系一致性33/39 (85%)免疫原性风险代理指标

总体而言，78% 的设计通过全部 5 项核心生物物理可开发性检测，同时保持高人源性，属性与行为良好的临床阶段分子一致。这证明 JAM-2 直接从模型产出可开发、药物级的抗 pMHC binder，绕过了下游工程的需求。

💡讨论：从胞内蛋白质组到个性化药物

首个全计算设计的 pMHC 治疗 candidate

JAM-2 可靠地从靶点序列从头设计药物级 VHH 抗体对抗 pMHC 靶点——无需免疫、无需 naïve 文库筛选、无需迭代优化。单次战役跨 5 个靶点、2 个 HLA 等位基因、3 类抗原，产出 5/5 命中，多数设计无需优化即满足全部早期可开发性标准。重构成双特异性 T 细胞衔接器后，驱动原代人 T 细胞以亚纳摩尔效力杀伤肽呈递细胞。据作者所知，这是首个被证实能通过 pMHC 驱动强效、抗原特异性 T 细胞杀伤的全计算设计抗体——这正是定义该类别治疗 candidate 的属性。

特异性 by design 而非 by chance

对 pMHC 而言，核心挑战是特异性而非亲和力。JAM-2 通过设计满足了这一标准。最清晰的体现是单个抗 KRAS 设计同时结合 G12V 和 G12C 致癌肽而豁免野生型——这一区分仅取决于一个侧链——并以 0.07 nM 杀伤。Cryo-EM 确认了设计的原子精度，证实模型将接触放在预期位置——单残基区分的结构基础。

打开胞内蛋白质组

靶向 pMHC 还将抗体扩展到原本不可成药的生物学。大多数疾病驱动因子在胞内作用，其 MHC 呈递肽是它们唯一的外部可见痕迹，因此针对这些复合物的设计将胞内靶点——转录因子、融合癌蛋白、突变驱动因子——开放给抗体。由于设计直接来自氨基酸序列且不需要结构信息，发现快速且易于并行化。这对新抗原可能最为重要——新抗原由患者自身突变和 HLA 型定义，序列驱动方法原则上可在筛选无法企及的时间尺度上达到 candidate。

医学精确化的长期弧线

这些进展延续了医学从粗糙到精确的长期弧线：化疗和放疗打击每个分裂细胞；数十年前，imatinib 和 trastuzumab 等靶向药将治疗收窄到单一癌蛋白；今天，基因型匹配药物和工程化 T 细胞将其调谐到肿瘤分子谱。JAM-2 将这一轨迹推向原子分辨率——仅用序列，binder 现在可被快速设计、构建和验证以读取单个侧链，而对于新抗原，则是患者独有的侧链。这不仅改善了对胞内蛋白质组的可及性，也为高度个性化的治疗铺平了新路径。

局限与下一步

这些体外结果为下一个测试奠定了基础：在体内解决蛋白质组范围的脱靶负债——超越此处检查的最近源自体肽——在体内可直接验证肿瘤控制和耐受性。从序列设计的能力将速率限制步骤从抗体发现转移到靶点选择。

🧫实验方法：从文库构建到功能验证

酵母表面展示文库构建

JAM-2 设计的 VHH 抗体寡核苷酸从 Twist Biosciences 订购为 300-nt 寡核苷酸池，带有侧翼 BsaI 识别位点用于 Golden Gate 组装。所有 DNA 均针对 S. cerevisiae 表达进行密码子优化。Golden Gate 组装反应过夜运行，使用 PCR 扩增的寡核苷酸池 DNA 克隆到酵母展示载体 pCTcon2 中。

纯化的 Golden Gate 反应物通过 Gene Pulser Xcell 电转化系统（BioRad）电转化至 NEB 10-beta 感受态 E. coli。系列稀释验证文库覆盖度大于 100 倍。转化细胞在 37°C LB 培养基中过夜培养（羄苄青霉素筛选），质粒文库用 QIAprep Spin Miniprep kit 提取。

组装好的文库被线性化并转化至 S. cerevisiae EBY100 菌株，使用标准醋酸锂和 DTT 酵母电转化方案。转化子系列稀释验证覆盖度至少 100 倍，在 SDCAA pH 4.5 培养基中 30°C 过夜培养。

FACS 分选与 pMHC 四聚体筛选

文库在 SDCAA pH 4.5 中 30°C 过夜饱和培养，以 25 倍稀释传代至新鲜培养基，生长 2-4 小时后离心收集。诱导阶段：细胞沉淀重悬至 OD600 = 1 于 SGCAA 培养基中，20°C 诱导 20 小时。

分选前，诱导酵母用 1% PBSA 洗涤两次，与 anti-c-Myc-AF488 抗体（1:100，Sigma-Aldrich 16-308）孵育标记全长 VHH 展示，同时加入目标 pMHC 抗原（浓度见表格）室温孵育 1 小时。4°C 离心洗涤后用 anti-His-AF647 二抗（1:100，R&D Systems IC0501R）冰上染色 30 分钟。Sony SH800 细胞分选仪进行分选，根据富集阶段使用正常或超纯度模式。

HLA 等位基因肽靶点肽序列pMHC 形式供应商筛选浓度
HLA-A*02:01AFP [158-166]FMNKFIYEI四聚体Kactus Bio MHC-HM407T10 nM
HLA-A*02:01MAGE-A4 [230-239]GVYDGREHTV四聚体Kactus Bio MHC-HM401T10 nM
HLA-A*02:01NY-ESO-1 [157-165]SLLMWITQC四聚体Acro Biosystems HL1-H52E810 nM
HLA-A*02:01WT1 [126-134]RMFPNAPYL四聚体Acro Biosystems HLW-H52E610 nM
HLA-A*03:01KRAS G12V [7-16]VVVGAVGVGK四聚体Kactus Bio MHC-HM418T100 nM

NGS 测序与 binder 分类

第二轮富集的 binder 通过 Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II kit 提取质粒，电转化至 E. coli，QIAprep Spin Miniprep 提取后提交 Oxford Nanopore 测序。Nanopore reads 比对到 JAM-2 生成的 VHH 编码 DNA，统计每个设计的 read 数。基于经验累积分布函数（ECDF）设定 read count 阈值区分 binder 与非 binder：通常 80-90% 的 reads 由少数设计贡献，ECDF 中的"肘部"提供自然阈值。

蛋白质生产与纯化

设计合成基因片段（Twist Biosciences），针对 Homo sapiens 表达密码子优化，Golden Gate 克隆至 pcDNA3.4。VHH-scFv（功能评估）以 VHH-(G4S)3-scFv-6xHis 格式生产；VHH-Fc（可开发性评估）以 VHH-G4S-Fc 格式生产。所有 Fc 标签蛋白为人 IgG1 亚类，含 L234A/L235A/P329G (LALA PG) 突变以降低效应功能。

质粒瞬时转染至 ExpiCHO 细胞（1 μg DNA/mL），双特异性分子共转染三个质粒（两条重链和轻链）1:1:1 比例总计 2 μg DNA/mL。链配对突变使正确异二聚体配对 >90%。转染后 6 天收获，上清 2000-3000 x g 离心澄清。VHH-Fc 滴量通过 BLI（Octet ProteinA 生物传感器）定量，标准曲线法计算。

蛋白质纯化：Fc 蛋白用 rProtein A Sepharose 或 Mag Sepharose PrismA 磁珠；His 标签蛋白用 Ni-IMAC 树脂。洗脱蛋白缓冲液交换至 PBS，A280 定量。

NFAT-荧光素酶 Jurkat 激活实验

对于 HLA-A*02:01 靶点（AFP、MAGE-A4、WT1、NY-ESO-1）：T2 细胞（ATCC CRL-1922）以 1E6 cells/mL 悬于 RPMI+10% FBS，50 μM 肽 + 1 μg/mL β2-微球蛋白脉冲 2 小时（37°C），30k 细胞/孔铺板。

对于 KRAS G12V：HLA-A*03:01 A549 细胞（BPS Bio #82469）过夜贴壁，次日 50 μM 肽 + 1 μg/mL β2m 脉冲 2 小时，20k 细胞/孔。

NFAT Luciferase Reporter Jurkat 细胞（BPS Bio #60621）以 0.5E6 cells/mL 加入 30k 细胞/孔。TCE 以 10 倍终浓度加入，37°C 孵育 18 小时。One-Step Luciferase Assay System（BPS Bio）100 μL/孔，室温 15 分钟后 SpectraMax iD3 读板。

PBMC 细胞毒性实验

冻存人 PBMC（BPS Bioscience）解冻后 RPMI-1640+10% FBS 37°C 5% CO₂ 过夜静息。HLA-A*03:01 A549 靶细胞用 CellTrace CFSE 染色，7000 细胞/孔铺板过夜贴壁。次日 50 μM KRAS 肽脉冲 2 小时，PBMC 以 E:T = 10:1 加入，与系列抗体稀释共培养 48 小时。7-AAD 染色区分活/死细胞，NovoCyte Quanteon 流式细胞仪采集。特异性细胞毒性 = (1 − %live_TCE / %live_no-TCE) × 100。2 复孔，GraphPad Prism v11 非线性回归计算 EC50。

📈补充数据：丙氨酸扫描、脱靶肽与亲和力验证

NY-ESO-1 丙氨酸扫描：NetMHCpan 预测与功能验证对照

对 NY-ESO-1 9C 肽（SLLMWITQC）的每个位置进行丙氨酸替换，使用 NetMHCpan 4.1 预测 HLA-A*02:01 结合亲和力变化，并与功能 T 细胞激活数据对照，以区分"设计直接接触丧失"与"肽呈递密度下降"两种机制。

变体肽序列IC50 (nM)IC50 相对 WT功能激活解读
野生型 9CSLLMWITQC422.151.000100%基准
S1AALLMWITQC736.181.744≥85%外围，耐受
L2ASALMWITQC10449.5924.753降低P2 锚残基破坏→呈递下降*
L3ASLAMWITQC452.581.072≥85%外围，耐受
M4ASLLAWITQC102.100.242严重削弱核心接触点
W5ASLLMAITQC1059.932.5118% (骤降)主要接触点
I6ASLLMWATQC1361.573.225损害维持 Met4/Trp5 几何
T7ASLLMWIAQC390.920.926≥85%外围，耐受
Q8ASLLMWITAC483.551.145≥85%外围，耐受
C9ASLLMWITQA17.120.041≥85%C 端锚，耐受
C9V (9V)SLLMWITQV4.550.011100%+锚修饰类似物，增强呈递

*L2A 的功能激活降低主要反映 HLA-A*02:01 P2 锚残基破坏导致肽呈递密度下降（IC50 增加 24.8 倍），而非设计直接接触丧失。M4A 虽然预测结合增强（IC50 降低 4 倍），但功能严重削弱，证明 Met4 是设计的直接接触点。W5A 同样显示功能骤降至 8%，确认 Trp5 为主要接触残基。

NY-ESO-1 脱靶肽面板

从 14,363 个 HLA-A*02:01 九肽的计算机筛选中选取 5 个与 NY-ESO-1 表位残基最相似的自体肽——最可能驱动严重脱瘤毒性的脱靶抗原。所有 5 个脱靶肽驱动的 T 细胞激活均等于或低于未脉冲细胞背景水平。

编号肽序列与 NY-ESO-1 差异
Off-Target 1SLCQKIEQC多个残基替换
Off-Target 2SLLGGITVV中央区域显著不同
Off-Target 3SLLMSIHNITrp5→Ser, C 端不同
Off-Target 4SLLNWRTKLMet4→Asn, C 端不同
Off-Target 5TLLMVITGVS1→T, 多处替换

双变体 KRAS 设计的亲和力验证（BLI + 流式细胞术）

提交 Cryo-EM 的双变体抗 KRAS G12V VHH 设计通过两种正交方法确认结合亲和力：

KRAS 变体肽序列

变体肽序列12 位残基供应商/目录号
野生型VVVGAGGVGKGly (G)Genscript RP30235
G12VVVVGAVGVGKVal (V)Genscript RP30229
G12CVVVGACGVGKCys (C)Genscript RP30236
G12DVVVGADGVGKAsp (D)Genscript RP30227

🔬Cryo-EM 数据处理与模型构建

样品制备

从头 VHH-Fc 在 ExpiCHO 中生产，Protein A 亲和捕获后 Superdex 200 SEC 纯化。生物素化 HLA-A*03:01&β2M&KRAS G12V 单体蛋白（KACTUS MHC-HM418B）重悬至 3 mg/mL。抗 β2-微球蛋白 Fab（clone 2M2, BioLegend 316302）通过固定化木瓜蛋白酶消化 IgG1 产生并 SEC 纯化至 4.5 mg/mL，作为基准标记辅助颗粒对齐。

复合物组装：326.69 μg VHH-Fc + 471 μg pMHC + 544.55 μg Fab（pMHC 和 Fab 相对 VHH-Fc 2.6 摩尔过量），冰上孵育 30 分钟，Superdex 200 SEC 分离完整复合物，浓缩至 1 mg/mL。

网格制备与数据采集

3 μL 复合物施加至 300-mesh UltrAuFoil R 1.2/1.3 网格（glow discharged），Vitrobot Mark IV 液乙烷 plunge-freeze。Glacios 200 kV 电镜 + Falcon 4 相机采集 12,358 张高倍图像，Leginon 软件，150,000x 放大，像素尺寸 0.93 Å/pixel，剂量率 6.98 e⁻/Ų/s，总曝光 3.60 s，累积剂量 25.14 e⁻/Ų，散焦范围 −1.0 至 −2.5 μm。

数据处理流程

全部处理在 cryoSPARC 4.7 中完成。CryoSPARC Live 4.7 预处理，CTF 拟合截止 6 Å 筛选得 11,028 张微图。模板 picker 挑取 1000 万颗粒，三轮 2D 分类后最佳颗粒生成 5 个 ab initio 模型。多轮异质精修、3D 分类、非均匀精修和 CTF 精修后，最终 3D 重构使用 566,000 颗粒，标称分辨率 3.30 Å（FSC = 0.143）。VHH-pMHC 界面局部精修改善至 3.25 Å。

模型构建

KRAS G12V-HLA 结构（PDB 7STF）和 VHH（PDB 1I3V）对接至 cryo-EM 密度图作为初始模板。COOT 手动调整 + Phenix 实空间精修迭代改善立体化学和模型-图系数相关性。MolProbity 验证最终模型。抗 β2m Fab（clone 2M2）因供应商未提供序列信息无法建模。

关键结构指标汇总

指标数值
总颗粒数566,000
全局分辨率3.30 Å (FSC = 0.143)
界面局部分辨率3.25 Å
全复合物 Cα RMSD（设计 vs 实验）0.93 Å
骨架原子 RMSD（506 残基, 2024 原子）0.998 Å
VHH 仅对 MHC 对齐后 Cα RMSD1.26 Å
MHC 对齐 RMSD0.84 Å
VHH 埋藏 pMHC 表面积1,018 Ų
MHC 贡献687 Ų (68%)
肽贡献331 Ų (32%)
VHH 重原子与肽接触比例29%
Val12 侧链溶剂可及面积变化109.9 → 0 Ų（完全埋藏）
电镜型号Thermo Fisher Glacios 200 kV + Falcon 4
数据处理软件cryoSPARC 4.7
模型构建软件COOT + Phenix

📚参考文献（33 篇）

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📄论文信息

标题：De novo design of drug-like pMHC-targeting T-cell engagers with JAM-2

机构：Nabla Bio

发布：2026 年 6 月（预印本/公司白皮书）

模型：JAM-2 —— 药物级抗体全计算从头设计模型

设计输入：仅 pMHC-I 复合物氨基酸序列（肽 + HLA 重链 + β2m），无需结构信息

设计产出：每靶点 ~84,000 个候选 VHH 设计，各配全原子复合物结构模型

靶点：5 个 pMHC-I（NY-ESO-1、MAGE-A4、WT1、AFP / HLA-A*02:01；KRAS G12V / HLA-A*03:01）

抗原类别：肿瘤相关抗原、癌胎抗原、新抗原

命中率：5/5，0.06%–3.10%

T 细胞激活 EC50：0.17–13 nM（4/5 亚纳摩尔）

NY-ESO-1 选择性：≥216 倍（vs 最近源自体肽，检测下限）

KRAS 双变体：G12V + G12C 同时结合，野生型/G12D 完全豁免

PBMC 杀伤 EC50：0.07 nM（G12V，最强设计）

Cryo-EM：3.25 Å（界面），Cα RMSD 0.93 Å（全复合物），566k 颗粒

可开发性：78% 通过全部 5 项检测（滴量/DSF/SEC/PAIA-OVA/BVP）

人源性：85% 设计 VH 种系一致性 > 80%

格式验证：VHH-scFv TCE → KiH IgG 样双特异性，效力与特异性保留

关键词：从头设计, pMHC, T 细胞衔接器, 双特异性抗体, VHH, 生成式模型, KRAS, 新抗原, Cryo-EM, 胞内蛋白质组, TCR-mimic, 药物级抗体, 可开发性, 多特异性, 个性化药物