激酶调控的挑战与机遇
蛋白质激酶是人类基因组中最大的酶家族之一，包含超过 500 个成员。它们通过磷酸化底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基来调控几乎所有的细胞信号通路——从增殖、分化到凋亡和迁移。激酶功能异常与癌症、炎症、代谢疾病和神经退行性疾病密切相关，使得激酶成为现代药物开发最重要的靶标类别之一。目前已有超过 80 种小分子激酶抑制剂获批上市，但它们面临一个根本性挑战：激酶催化结构域的高度保守性。
激酶的催化结构域由 N 端和 C 端两个叶组成，中间通过铰链区连接。ATP 结合口袋位于两叶之间的裂缝中。由于几乎所有激酶共享这一保守的 ATP 结合口袋，传统小分子抑制剂很难实现高度选择性——这导致了诸多脱靶毒副作用。I 型抑制剂结合活性构象，II 型抑制剂结合非活性构象，但它们都依赖 ATP 口袋的占据，选择性天花板有限。
别构调控提供了一条绕过这一困境的路径。激酶的别构位点——如 SH2/SH3 结合域、调节性螺旋、自抑制区域——在不同激酶间变异更大，为选择性操控提供了更丰富的靶标空间。然而，别构调控的天然机制复杂且难以用小分子精确模拟。Baker 实验室提出了一种全新的策略：用从头设计的微型蛋白直接结合激酶结构域表面的别构位点，通过稳定特定的构象状态来激活或抑制激酶活性。这些微型蛋白是基因编码的，可以在细胞内直接表达，从而实现对信号通路的精准、可编程操控。
技术架构：从头设计激酶调控蛋白的计算管线
这项工作的核心技术架构建立在 Baker 实验室成熟的从头蛋白质设计管线之上，但在关键环节进行了针对激酶调控的特殊创新。整个管线可以分为四个核心阶段：构象状态选择与靶点定义、骨架生成与界面设计、序列设计与计算过滤、实验筛选与功能验证。
第一阶段：构象状态选择与靶点定义。与传统的 binder 设计不同——后者通常只要求 binder 结合靶标表面的某个区域——激酶调控要求 binder 不仅结合，还要稳定激酶的特定构象状态。FAK 激酶结构域存在多种构象状态：活性状态（αC-helix in，DFG-in）、非活性状态（αC-helix out，DFG-out）以及中间态。研究团队首先分析了 FAK 激酶结构域在不同构象状态下的晶体结构和冷冻电镜结构，识别了每种构象状态下暴露在表面的别构位点。这些位点包括 αC-helix 外侧的疏水凹槽、N 端叶与 C 端叶之间的铰链区附近表面、以及 C 端叶的调节性螺旋区域。对于每个构象状态，团队定义了热点残基（hotspot residues）——即 binder 需要接触的关键表面残基，这些残基在不同构象状态间的暴露程度不同，为构象选择性提供了结构基础。
第二阶段：骨架生成与界面设计。研究团队使用 RFdiffusion 进行骨架生成。RFdiffusion 是 Baker 团队开发的基于 RoseTTAFold 架构的扩散模型，从随机噪声出发逐步去噪生成蛋白质骨架。在 binder 设计模式下，RFdiffusion 接收靶标蛋白的三维结构和热点残基列表作为条件输入，生成能结合靶标指定区域的小型蛋白质骨架（通常 40-80 个残基）。针对激酶调控的特殊需求，团队对 RFdiffusion 的条件生成进行了关键调整：对于抑制性 binder，条件信号引导骨架结合非活性构象的别构位点，通过空间位阻阻止 αC-helix 回到活性位置；对于激活型 binder，条件信号引导骨架结合活性构象的别构位点，稳定 αC-helix 的活性取向并阻止其向非活性构象转换。这种"构象状态条件化"是这项工作区别于普通 binder 设计的核心创新。
第三阶段：序列设计与计算过滤。RFdiffusion 生成的骨架随后输入 ProteinMPNN 进行序列设计。ProteinMPNN 以自回归方式从 N 端到 C 端逐残基生成氨基酸身份，在天然骨架上的序列恢复率达到 52.4%。对于每个骨架，ProteinMPNN 设计 8-16 条序列，然后用 AlphaFold2 或 ESMFold 对序列-结构一致性进行计算验证。通过的计算过滤标准包括：设计序列被预测折叠的结构与设计目标骨架高度一致（pLDDT > 80，RMSD < 2 Å），binder 与靶标的界面预测准确（界面 pAE 低，ipTM 高），以及界面面积和形状互补性满足阈值。这一"RFdiffusion → ProteinMPNN → AlphaFold2 过滤"的三步管线是 Baker 实验室从头设计的事实标准，但在激酶调控场景中，过滤标准还额外考虑了 binder 是否确实结合了目标构象状态的别构位点而非其他表面区域。
第四阶段：实验筛选与功能验证。通过计算过滤的设计序列被合成基因、在细菌中表达纯化，然后用生化实验测试其对 FAK 激酶活性的影响。关键的是，研究团队不仅测试了结合（通过表面等离子共振 SPR 或生物层干涉 BLI），还直接测试了功能——即 binder 是否改变 FAK 的激酶活性。这种"功能优先"的筛选策略使得团队发现了不仅有抑制剂还有激活剂的设计，这是单纯结合测试无法揭示的。
FAK构象状态靶向策略
FAK（Focal Adhesion Kinase，黏着斑激酶）是一种非受体型酪氨酸激酶，在细胞迁移、增殖和存活中发挥关键作用。FAK 过度激活与多种实体瘤相关，使其成为抗癌药物开发的重要靶标。FAK 的激酶结构域具有典型的双叶结构，其活性受 αC-helix 位置和 DFG 基序构象的调控。在自抑制状态下，FAK 的 N 端 FERM 结构域与激酶结构域相互作用，抑制激酶活性；当 FAK 被招募到黏着斑并发生自磷酸化（Y397）后，FERM 结构域解离，激酶结构域转为活性构象。
研究团队选择 FAK 作为模型系统的原因有三：第一，FAK 激酶结构域已有多个不同构象状态的实验结构，为计算设计提供了结构基础；第二，FAK 的别构调控机制已有较好的生化理解，可以指导靶点选择；第三，FAK 在癌症中的重要性为开发治疗性调控剂提供了明确的转化动机。
在设计策略上，团队针对 FAK 激酶结构域的至少两种不同构象状态设计了 binder。对于抑制性设计，团队靶向了 FAK 非活性构象下暴露的别构表面——这些表面在活性构象中被 αC-helix 或调节环遮挡。binder 结合这些表面后，通过空间位阻和构象锁定阻止 FAK 从非活性状态向活性状态转换。对于激活型设计，团队靶向了 FAK 活性构象下暴露的别构表面——binder 结合后稳定活性构象，阻止 αC-helix 外翻或 DFG 翻转，从而维持激酶的高活性状态。这种"构象状态选择性"设计是传统小分子别构调控剂难以实现的，因为小分子通常结合口袋内部，而设计微型蛋白可以结合大的平坦表面，覆盖更广的别构区域。
总共 96 个设计通过了计算过滤并进入实验测试。这些设计覆盖了 FAK 激酶结构域表面的多个不同别构位点，代表了不同的构象状态靶向策略。这种多样性是关键——它使得团队能够系统性地探索哪些别构位点的靶向最有效地调控激酶活性，为理解激酶别构调控机制提供了结构-功能映射。
实验验证：从96个设计到33个调控剂
96 个设计蛋白在细菌中表达纯化后，首先通过体外激酶活性实验测试其对 FAK 自磷酸化和底物磷酸化的影响。实验结果令人瞩目：33 个设计（34.4% 的成功率）显著改变了 FAK 的激酶活性——这个成功率远高于传统 binder 设计的典型水平，反映了构象状态靶向策略的有效性。
在 33 个调控剂中，大多数表现为抑制剂，但令人意外的是，部分设计表现出显著的激活效果。团队对四个最有效的调控剂进行了详细的生化表征。两个抑制剂展现出低纳摩尔级的 IC50 值——这意味着它们在纳摩尔浓度下就能将 FAK 激酶活性抑制 50%，与当前最好的小分子 FAK 抑制剂相当。两个激活剂将 FAK 激酶活性提高了两倍以上，这是首次报道的通过从头设计蛋白质实现的激酶激活。
激活型设计的发现具有特殊的科学意义。传统的激酶药物开发几乎完全聚焦于抑制，因为小分子别构激活剂的设计极其困难——需要精确稳定活性构象而非简单占据口袋。从头设计微型蛋白可以通过大面积结合激酶表面来稳定特定的构象状态，为激酶激活提供了一种全新的范式。激酶激活剂在基础研究中具有重要价值——它们可以用于研究激酶活性上调的生理效应，在特定疾病模型中可能具有治疗潜力（如激活 PI3K/Akt 通路促进细胞存活）。
团队还通过 SPR 或 BLI 测定了调控剂与 FAK 激酶结构域的结合亲和力。关键发现是，结合亲和力与调控效力之间并非简单的线性关系——一些高亲和力 binder 表现为抑制剂，另一些则表现为激活剂，取决于它们结合的构象状态和别构位点。这一发现强调了"构象状态靶向"而非单纯"亲和力优化"在激酶调控设计中的核心地位。
从体外到细胞：基因编码的信号通路操控
体外生化验证之后，研究团队将调控剂的表达基因转入哺乳动物细胞，测试它们在细胞内是否保持相同的调控效果。这是从头设计微型蛋白相比小分子药物的核心优势之一：它们是基因编码的，可以通过质粒或病毒载体在特定细胞类型中表达，实现时空精确的信号通路操控。
细胞实验结果验证了体外发现：抑制型设计在细胞中抑制了 FAK 自磷酸化和下游底物磷酸化，激活型设计在细胞中提高了 FAK 激酶活性。这证明了设计微型蛋白在细胞内环境中正确折叠、定位到 FAK、并发挥预期的调控功能。这一点并不 trivial——细胞内环境与体外纯化系统存在显著差异，包括分子拥挤效应、竞争性结合伙伴、蛋白酶降解等。设计蛋白能在细胞内保持功能，验证了它们的稳定性和生物相容性。
基因编码的激酶调控剂具有小分子无法实现的优势：第一，可编程性——通过修改启动子可以控制表达水平和组织特异性；第二，可组合性——可以同时表达多个调控剂实现对多条信号通路的协同操控；第三，可诱导性——可以与诱导表达系统（如 Tet-On）结合实现时间控制；第四，可检测性——可以融合荧光标签实时监控调控剂的表达和定位。这些特性使得设计微型蛋白成为细胞信号通路研究的强大工具。
跨家族迁移：从FAK抑制剂到Src抑制剂
这项工作最令人兴奋的成果之一是跨激酶家族的迁移。FAK 和 Src 同属非受体型酪氨酸激酶，但它们在序列和结构上存在显著差异。然而，激酶催化结构域的整体折叠是保守的，特别是别构调控区域的空间布局存在一定程度的相似性。研究团队利用这种相似性，将 FAK 抑制剂的设计原理迁移到 Src 上。
迁移策略的核心是"界面重设计"。团队选取了在 FAK 上表现最好的抑制剂设计，保留了 binder 的整体骨架拓扑——因为骨架已经过实验验证是稳定且可折叠的——然后针对 Src 激酶结构域的表面残基重新设计了 binder-靶标界面。具体操作是：将 Src 激酶结构域的结构替换 FAK 结构作为 RFdiffusion 的靶标输入，在保持 binder 骨架不变的条件下重新运行界面设计模块，然后用 ProteinMPNN 设计新的界面序列。这种"骨架复用 + 界面重设计"策略大幅减少了计算量，因为不需要重新生成和筛选数千个骨架。
实验验证表明，重设计的 Src binder 确实抑制了 Src 激酶活性。这一成功具有深远的意义：它证明了激酶别构调控的设计原理可以在不同激酶间迁移，为建立"激酶调控平台"提供了概念验证。如果每个新激酶靶标只需要界面重设计而非从头设计，那么整个激酶组的系统调控将成为可能——人类基因组编码的 500 多个激酶中，任何具有结构信息的成员都可以成为设计调控剂的靶标。
这种迁移策略与抗体工程的"人源化"有异曲同工之妙——在抗体工程中，保留 CDR 区域（功能核心）而替换框架区域（载体）；在激酶调控剂迁移中，保留骨架拓扑（稳定核心）而重设计界面（特异性决定因素）。这种策略的效率远高于针对每个新靶标从头设计，为平台的可扩展性奠定了基础。
RFD2-MI：磷酸化状态特异性binder设计
同一研究团队还在学术报告中展示了这项工作的第二线进展：RoseTTAFold Diffusion 2 for Molecular Interfaces（RFD2-MI），一个用于设计共价修饰蛋白（包括磷酸化靶标）binder 的全原子生成框架。如果说 FAK/Src 调控剂解决的是"如何操控激酶活性"的问题，那么 RFD2-MI 解决的是"如何识别激酶的信号状态"的问题。
蛋白质磷酸化是细胞信号传导的核心语言。激酶通过磷酸化底物来传递信号，而磷酸化状态的识别——即区分磷酸化和未磷酸化的蛋白——对于理解信号通路动态至关重要。天然细胞使用 SH2、PTB 等结构域来识别磷酸化酪氨酸，但这些天然结构域的特异性和亲和力有限，且难以编程。
RFD2-MI 的核心创新在于全原子条件生成。与原始 RFdiffusion 使用 Cα 表示不同，RFD2-MI 在全原子表示下运行扩散过程，可以精确处理磷酸基团的原子坐标。这使得模型能够"看到"磷酸化修饰的精确化学结构——磷原子、氧原子的空间排列、电荷分布——并设计出与这些特征精确互补的 binder 界面。团队用 RFD2-MI 生成了针对 CD3ε、EGFR、INSR 和 STAT5 上五个磷酸化酪氨酸位点的 binder，这些 binder 以与天然磷酸酪氨酸结合域相当的亲和力结合其目标磷酸化肽段，同时能区分未磷酸化和非目标肽段。
在活细胞中，单颗粒追踪实验进一步显示，一个 EGFR 磷酸化位点 binder 在 EGF 刺激后被招募到细胞膜——这证明了 binder 在细胞内能够选择性识别其靶标的信号状态。这种"信号状态感知"能力为细胞信号通路研究提供了全新工具：研究者可以可视化特定磷酸化事件的发生时间和位置，而不需要依赖磷酸化特异性抗体。
RFD2-MI 与 FAK/Src 调控剂形成了互补的技术对：调控剂操控激酶活性（写入信号），磷酸化 binder 读取信号状态（读出信号）。两者结合，构成了一个完整的"信号通路编程接口"——可以写入和读出细胞信号网络中的任意节点。
产业意义与竞争格局
这项工作对生物医药产业具有多重意义。首先，基因编码的激酶调控剂填补了小分子药物和抗体药物之间的空白。小分子激酶抑制剂面临选择性瓶颈，抗体药物虽然选择性高但无法进入细胞内靶向胞内激酶。设计微型蛋白体积小（40-80 残基 vs 抗体的 ~1300 残基），可以穿透细胞膜（通过细胞穿透肽融合或直接内化），同时具有高度选择性（通过精确设计的界面）。这使得胞内激酶的选择性调控成为可能。
其次，激活型设计开辟了全新的治疗方向。目前几乎所有激酶药物都是抑制剂，但某些疾病场景需要激酶活性的恢复——例如在胰岛素抵抗中激活 IR/INSR，在神经退行性疾病中激活促存活激酶。从头设计微型蛋白激活剂为这些"不可成药"靶标提供了全新路径。
第三，跨家族迁移策略意味着平台可扩展性。一旦在 FAK 上验证了设计原理，迁移到新激酶只需界面重设计——计算量小、周期短。这使得针对整个激酶组的系统调控成为可能，为个性化医疗和组合靶向治疗提供新工具。
在竞争格局方面，Baker 实验室在从头蛋白质设计领域处于绝对领先地位。这项工作进一步巩固了其技术护城河：构象状态靶向设计、跨家族迁移、RFD2-MI 磷酸化感知——每一项都是独立的技术突破，组合在一起构成了完整的信号通路编程平台。Baker 联合创立的多家公司（Neoleukin、Arzeda、Vilya、Xaira Therapeutics）可能成为这一平台技术的商业化载体。
未来展望：从激酶调控到信号通路重编程
这项工作展示的不仅是一种新的激酶调控方法，而是一种"信号通路编程"的范式。如果将细胞信号网络类比为一台计算机，那么激酶是其中的处理器，磷酸化事件是数据流，而设计微型蛋白则是可编程的控制指令。
在短期，我们可以预见以下发展方向：第一，扩展到更多激酶家族——利用跨家族迁移策略，系统性地为整个激酶组设计调控剂，构建"激酶调控剂工具箱"；第二，结合 RFD2-MI 磷酸化 binder，实现信号通路的闭环控制——调控剂写入信号，磷酸化 binder 读出信号状态，形成反馈回路；第三，与合成生物学结合，将设计调控剂整合到基因回路中，实现细胞行为的可编程控制。
在中期，激酶调控平台可能与光遗传学或化学遗传学结合，实现外部可控的激酶活性调节。例如，将光控别构开关（如 LOV2 结构域）与设计微型蛋白融合，用光照控制调控剂的结合与释放，实现毫秒级时间分辨的激酶活性操控。这种"光控激酶调控"将为神经生物学和发育生物学研究提供前所未有的工具。
在长期，如果设计微型蛋白能够通过基因治疗载体（如 AAV）递送到体内特定组织，它们可能成为新一代基因药物——不是像 CRISPR 那样修改基因，而是在蛋白质层面调控信号通路活性。这种"蛋白质层面基因治疗"可能比基因编辑更安全、更可控，因为它是可逆的（调控剂降解后信号通路恢复正常），且不改变基因组序列。
David Baker 在 2024 年获得诺贝尔化学奖后，其实验室的每一项新工作都在扩展蛋白质设计的边界。从结构预测到从头设计，从 binder 到调控剂，从单一分子到信号通路编程——这项激酶调控工作标志着蛋白质设计正在从"创造分子"向"操控生命"演进。当设计蛋白开始直接改写细胞信号网络，我们正在见证合成生物学与蛋白质设计的深度融合，一个"可编程细胞信号"的新时代正在到来。
参考信息
原始论文：Lee, G.R., Coventry, B., Klupt, K.A., Fernández-Escamilla, A.M., et al. "De novo design of selective kinase modulators." bioRxiv 2026.07.10.737808 (2026).
关联工作：Bauer, M. et al. KILU Seminar: "AI-Guided Protein Design to Control Cellular Signaling" — Baker Lab, Institute for Protein Design, University of Washington (2026). 包含 RFD2-MI 磷酸化 binder 设计的首次公开报告。
核心技术论文：
1. Watson, J.L. et al. "De novo design of protein structure and function with RFdiffusion." Nature 620, 1086-1094 (2023).
2. Dauparas, J. et al. "Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN." Science 378, 49-56 (2022).
3. Jumper, J. et al. "Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold." Nature 596, 583-589 (2021).
4. Baek, M. et al. "Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network." Science 373, 871-876 (2021).
5. Muratspahić, E. et al. "De novo design of miniprotein agonists and antagonists targeting G protein-coupled receptors." bioRxiv 2025.03.23.644666 (2025).
6. Coventry, B. et al. "Improved protein binder design using β-pairing targeted RFdiffusion." Nature Communications (2025).
相关机构：Institute for Protein Design (University of Washington), Baker Lab, Elowitz Lab (Caltech), Nabet Lab.
开源工具：RFdiffusion (GitHub), ProteinMPNN (GitHub), AlphaFold2/ColabFold (GitHub), ESMFold (GitHub).